کلونکردن ژن survivin انسانی در وکتور پروکاریوتی pET-28a و ارزیابی بیان پروتئین در باکتری E.coli BL21(DE3) | ||
| زیست فناوری | ||
| Article 2, Volume 11, Issue 3 - Serial Number 26, 1399, Pages 8-14 PDF (997.86 K) | ||
| Document Type: پژوهشی اصیل | ||
| Authors | ||
| مهسا تیرمومنین; فرنگیس عطائی* ; سامان حسین خانی | ||
| دانشگاه تربیت مدرس | ||
| Abstract | ||
| مهارکننده آپوپتوز (IAP) یک خانواده از پروتئینها هستند که با مهار فعالیت کاسپاز مرگ سلول را متوقف میکنند. Survivin کوچکترین پروتئین شناخته شده از این خانواده است که در سلولهای سرطانی مشاهده میشود اما در بافتهای نرمال بجز بافت جنینی مشاهده نشده است. survivin ممکن است بهعنوان یک مارکر جدید برای شناسایی و درمان سرطان مورد استفاده قرار گیرد. هدف از این پژوهش، کلونینگ ژن survivin در وکتور pET-28a و بیان پروتئین در باکتری E.coli بود. ژن survivin با روش PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و الگوی pcDNA-survivin تکثیر شد. محصول PCR و پلاسمید pET-28a با آنزیمهای محدودگر HindIII/NheIبرش داده و survivin درون وکتور برش خورده الحاق شد. سپس محصول الحاق شده به باکتری E.coli DH5a ترنسفورم و با استفاده از آنتی بیوتیک کانامایسین غربالگری شد. کلونیها با روش PCR ارزیابی شده و پلاسمید کلونی مثبت با روش هضم دوگانه غربالگری شده، در نهایت یک کلونی مثبت با تعیین توالی تایید شد. پلاسمید نوترکیب با روش شیمیایی به باکتری بیانی E.coli (BL21) ترنسفورم شد. بیان survivin در شرایط مختلف انجام و سطح بیان با SDS-PAGE بررسی شد. اندازه قطعه تکثیرشده توسط PCR با استفاده از ژل آگارز تایید شد. پلاسمید pET-28a برش خورده نیز فعالیت آنزیمی را تایید کرد. قطعه کلون شده پس از توالییابی تشابه 100% با survivin انسانی داشت. افزودن IPTG موجب بیان پروتئین survivin در تمام شرایط خصوصا در دمای 37 درجه سانتیگراد از زمان 2 ساعت پس از القا شد اما در تمام شرایط، عمده survivin بیان شده در باکتری به صورت تجمعی بود. | ||
| Keywords | ||
| Survivin; PCR; کلونینگ; pET-28a; BL21(DE3) | ||
| References | ||
|
| ||
|
Statistics Article View: 250 PDF Download: 92 |
||
| Number of Journals | 45 |
| Number of Issues | 2,171 |
| Number of Articles | 24,674 |
| Article View | 24,447,981 |
| PDF Download | 17,555,117 |